Ein Massenspektrum lesen: mehrfach geladene Ionen und der Massenabgleich
Warum ein Peptidspektrum mehrere Signale zeigt, wie daraus die Molekülmasse wird und welche Abweichungen auf welche Veränderung hindeuten.
Das Massenspektrum auf einem Analysezertifikat sieht auf den ersten Blick unzugänglicher aus als das Chromatogramm, ist aber leichter zu lesen. Es beantwortet genau eine Frage: Hat der Hauptpeak die erwartete Masse? Alles Weitere ist Zusatzinformation.
Verwirrend ist zunächst, dass ein einzelnes Peptid mehrere Signale erzeugt. Der Grund ist die Ionisierung, und er lässt sich in wenigen Sätzen erklären. Danach ist die Auswertung eine Subtraktion.
Warum mehrere Signale erscheinen
Bei der Elektrospray-Ionisierung nimmt ein Peptid mehrere Protonen auf und trägt dadurch mehrere positive Ladungen. Das Spektrometer misst nicht die Masse, sondern das Verhältnis von Masse zu Ladung. Ein Peptid mit dreifacher Ladung erscheint deshalb bei einem Drittel seiner Masse.
Da die Ladungszahl variiert, entsteht eine Serie von Signalen desselben Moleküls. Diese Serie ist charakteristisch und erlaubt die Rückrechnung auf die tatsächliche Molekülmasse. Moderne Auswertesoftware macht das automatisch und gibt die dekonvolutierte Masse an.
Der eigentliche Abgleich
Auf dem Zertifikat stehen zwei Zahlen: die theoretische Masse aus der Summenformel und die gemessene Masse. Stimmen beide innerhalb der Messgenauigkeit überein, ist die Identität bestätigt. Für ein Peptid mittlerer Größe liegt die Toleranz typischerweise bei unter einer Masseneinheit.
Fehlt die theoretische Masse, ist der Vergleich nicht durchführbar. Sie steht bei Kronen Peptides zusätzlich in der Spezifikationstabelle jeder Produktseite und wird dort aus der Summenformel berechnet. Der Katalog steht unter Peptide kaufen.
Monoisotopisch gegen durchschnittlich
Es gibt zwei gebräuchliche Massenangaben: die monoisotopische Masse, die nur die häufigsten Isotope berücksichtigt, und die durchschnittliche Masse, die die natürliche Isotopenverteilung einbezieht. Beide unterscheiden sich bei größeren Peptiden um mehrere Einheiten. Ein Vergleich der falschen Paare erzeugt eine scheinbare Abweichung.
Deshalb sollte auf dem Zertifikat stehen, welche der beiden gemeint ist. Bei kurzen Peptiden ist der Unterschied vernachlässigbar, bei Sequenzen über dreißig Resten nicht mehr. Das ist eine der häufigsten Fehlinterpretationen.
Was eine Abweichung von 16 bedeutet
Eine um 16 Masseneinheiten erhöhte Masse entspricht einem zusätzlichen Sauerstoffatom und damit einer Oxidation. Betroffen sind vor allem Methionin und Cystein. Das ist die häufigste lagerungsbedingte Veränderung an Peptiden.
Erscheint dieses Signal deutlich neben dem Hauptsignal, ist ein Teil des Materials oxidiert. Chromatographisch ist der Unterschied oft gering, massenspektrometrisch eindeutig. Die zugehörigen Lagerregeln stehen im Schwerpunkt Lagerung und Handhabung.
Was eine Abweichung um eine Aminosäure bedeutet
Fehlt eine Aminosäure, ist die Masse um deren Restmasse verringert — je nach Aminosäure zwischen 57 und 186 Einheiten. Das ist eine Deletionssequenz. Ist die Masse entsprechend erhöht, wurde eine Aminosäure doppelt eingebaut.
Beide sind im Spektrum eindeutig und im Chromatogramm häufig nicht aufgelöst. Genau darin liegt der komplementäre Wert der beiden Verfahren. Die Systematik beschreibt der Artikel zu Deletionssequenzen.
Was das Spektrum nicht zeigt
Die Reihenfolge der Aminosäuren. Zwei Sequenzen mit identischer Zusammensetzung und unterschiedlicher Reihenfolge haben dieselbe Masse. Für die vollständige Sequenzbestätigung braucht es eine Fragmentierung im Tandem-Verfahren.
In der Routineprüfung wird das selten durchgeführt, weil der Syntheseweg die Reihenfolge festlegt. Für neue oder besonders kritische Sequenzen lohnt die Nachfrage. Die Sequenz steht in der Spezifikationstabelle jeder Produktseite.
Bei Mischungen und Glykoproteinen
Eine Mischung zeigt die Signalserien aller Komponenten nebeneinander. Fehlt eine erwartete Masse, fehlt die Komponente — das ist die einfachste Zusammensetzungskontrolle. Die Besonderheiten beschreibt der Artikel zur Qualitätsprüfung bei Mischungen.
Bei glykosylierten Proteinen wie ACE-031 entsteht statt eines Signals eine Massenverteilung, weil die Zuckerketten variieren. Dort wird ein Bereich angegeben. Ein einzelner exakter Wert wäre in diesem Fall unplausibel.
Der Durchgang in dreißig Sekunden
Theoretische und gemessene Masse suchen, Differenz bilden, bei Abweichung prüfen ob 16 oder eine Aminosäurenmasse. Drei Schritte, die den überwiegenden Teil der Befunde abdecken. Mehr braucht es für eine Routineprüfung nicht.
Zusammen mit dem Chromatogramm-Durchgang ergibt das eine vollständige Zertifikatsprüfung in einer Minute. Der Aufbau des gesamten Dokuments steht im Artikel zum Zertifikat Feld für Feld.