Verdünnungsreihen ansetzen: Fehlerquellen und wie sie sich vermeiden lassen
Serielle gegen direkte Verdünnung, Pipettierfehler, Adsorption und Mischgüte — was eine Dosis-Wirkungs-Kurve tatsächlich verzerrt.
Eine Dosis-Wirkungs-Kurve ist nur so gut wie die Verdünnungsreihe darunter. Fehler in der Reihe verschieben die Kurve systematisch und sind aus dem Ergebnis heraus nicht erkennbar. Sie sehen aus wie Biologie.
Vier Fehlerquellen decken den überwiegenden Teil ab: die Wahl zwischen serieller und direkter Verdünnung, Pipettierfehler, Adsorption an Gefäßwände und unzureichendes Mischen. Alle vier sind bekannt und alle vier treten regelmäßig auf. Die folgenden Punkte beschreiben sie.
Seriell gegen direkt
Bei der seriellen Verdünnung wird jede Stufe aus der vorherigen hergestellt, wodurch sich Fehler multiplizieren. Bei der direkten wird jede Stufe einzeln aus der Stammlösung angesetzt, wodurch Fehler unabhängig bleiben. Die direkte ist genauer und braucht mehr Stammlösung.
Für kurze Reihen über zwei bis drei Zehnerpotenzen ist die direkte Verdünnung praktikabel und vorzuziehen. Für Reihen über sechs Zehnerpotenzen ist die serielle unvermeidlich. Die Rechnung übernimmt der Rekonstitutions-Rechner.
Wie sich Fehler seriell fortpflanzen
Ein Pipettierfehler von zwei Prozent in der ersten Stufe wirkt sich auf alle folgenden aus. Über acht Stufen summiert sich das auf mehr als fünfzehn Prozent an der letzten. Die Kurve wird dadurch gestaucht oder gestreckt.
Genau deshalb ist der erste Verdünnungsschritt der kritischste. Er sollte mit dem größten sinnvollen Volumen erfolgen, weil relative Pipettierfehler bei größeren Volumina kleiner sind.
Pipettenvolumen richtig wählen
Eine Pipette arbeitet im oberen Drittel ihres Bereichs am genauesten. Zehn Mikroliter mit einer Zweihundert-Mikroliter-Pipette zu setzen ist deutlich ungenauer als mit einer Zwanzig-Mikroliter-Pipette. Der Unterschied kann mehrere Prozent betragen.
Für Verdünnungsreihen lohnt es sich deshalb, die Volumina so zu wählen, dass jede Pipette im günstigen Bereich arbeitet. Das ist eine Planungsentscheidung vor dem Ansatz und kostet keine Zeit.
Adsorption an Gefäßwände
Peptide adsorbieren an Kunststoff, und der relative Verlust ist bei niedrigen Konzentrationen am größten. Gerade das untere Ende einer Verdünnungsreihe ist damit systematisch betroffen. Kationische Sequenzen sind besonders anfällig.
Abhilfe schaffen Gefäße mit geringer Bindungsneigung oder ein Zusatz von Trägerprotein, wo der Assay es zulässt. Beides gehört ins Protokoll. Die Zusammenhänge stehen im Artikel zum Aliquotieren.
Mischen zwischen den Stufen
Wird nach jeder Verdünnungsstufe nicht ausreichend gemischt, ist die entnommene Menge für die nächste Stufe nicht repräsentativ. Der Fehler wirkt sich seriell fort. Sanftes Auf- und Abpipettieren mehrfach ist ausreichend.
Kräftiges Vortexen ist bei Peptiden zu vermeiden, weil es Schaumbildung und Denaturierung begünstigt. Der Mittelweg ist mehrfaches langsames Mischen mit der Pipette. Er kostet Sekunden je Stufe.
Spitzenwechsel
Zwischen den Stufen gehört die Spitze gewechselt, weil an ihr Material der höheren Konzentration haftet. Ohne Wechsel wird jede Stufe systematisch überhöht. Bei einer Reihe über acht Stufen ist der Effekt am unteren Ende erheblich.
Das ist der am häufigsten aus Bequemlichkeit übersprungene Schritt. Er kostet acht Spitzen und macht den Unterschied zwischen einer sauberen und einer verzerrten Kurve.
Die Kontrollen
In jede Reihe gehören eine Nullkontrolle mit Puffer, eine Lösungsmittelkontrolle mit dem verwendeten Rekonstitutionsmittel und, wo verfügbar, eine Positivkontrolle. Erst diese drei machen die Reihe interpretierbar. Ohne sie ist ein fehlender Effekt nicht von einem fehlgeschlagenen Ansatz unterscheidbar.
Welche Substanz als Positivkontrolle taugt, nennt das Peptid-Lexikon je Eintrag. Für viele Rezeptorsysteme gibt es einen etablierten Referenzliganden.
Frische Reihe je Versuchstag
Verdünnte Lösungen sind deutlich instabiler als die Stammlösung, weil die Konzentration niedriger und der relative Adsorptionsverlust höher ist. Eine Reihe vom Vortag ist nicht dieselbe Reihe. Sie sollte je Versuchstag frisch angesetzt werden.
Die Stammlösung wird dafür als Aliquot aufgetaut. Der Ablauf steht im Artikel zum Aliquotieren. Der Mehraufwand beträgt wenige Minuten.
Die fünf Regeln
Direkte Verdünnung wo möglich, Pipetten im oberen Bereich nutzen, Spitzen wechseln, ausreichend mischen, Reihe frisch ansetzen. Fünf Regeln, die zusammen keine zusätzliche Zeit kosten. Sie entscheiden über die Form der Kurve.
Die Konzentrationsberechnung übernimmt der Rekonstitutions-Rechner. Die weiteren Handhabungsartikel stehen unter Lagerung und Handhabung.